Kromatografi
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
Penggolongan kromatografi
Atas dasar mekanisme pemisahan :
1. kromatografi serapan (adsorption chromatography)
2. kromatografi partisi (partition chromatography)
3. kromatografi eksklusi (exclusion chromatography)
4. kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography)
5. kromatografi afinitas (affinity chromatography)
Atas dasar (wujud) fase gerak:
1. kromatografi gas (fase geraknya adalah gas)
2. kromatografi cairan (fase geraknya adalah zat cair)
Atas dasar bentuk fase diam:
1.Kromatografi planar
a. kromatografi lapis tipis
b. kromatografi kertas
c. kromatotron
2.Kromatografi kolom
a. kolom terbuka
b. kromatografi gas,
c. kromatografi cair kinerja tinggi
1. KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau biasa juga di sebut HPLC ( High Perfomance Liquid Chromatography ) dikembangkan pada tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakn tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuka analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain farmasi, lingkungan bioteknologi, polimer, dan industri – industri makanan. Beberapa perkembangan kckt yang terbaru antara lain : miniaturisasi sistem KCKT, penggunaan kckt untuk analisis asam – asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat , dan analisis senyawa – senyawa kiral.
Kegunaan KCKT antara lain : untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian ( impurities ); analisis senyawa – senyawa tidak mudah menguap ( non – volatif ); penentuan molekul – molekul netral; ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa – senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa – senyawa dalam jumlah sekelumit ( trace element ), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. Kckt merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunalkan untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa – senyawa tertentu seperti asam – asam amino, asam – asam nukleat dan protein – protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa – senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk – produk degradasi dalam sediaan farmasi, memonitor sampel – sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintesis.
Keterbatasan metode kckt adalah untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa ( MS ). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Cara kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat- zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi,dikarenakan solut –solut ini melewati suatu kolom kromatografi .pemisahan solut –solut ini diatur oleh distribusi solutdalam fase gerak dan fase diam .penggunaan kromatograficai secara sukses terhadap suatu masa-lah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai kondisi operasional seperti jenis kolom,fase gerak,panjang dan diameter kolom,kecepatan alir fase gerak,suhu kolom,dan ukuran sampel.untuk tujuan memilih kombinasikondisi kromatografiyang terbaik,maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam faktor yang mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair..
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen yaitu; (1) wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran gerak, (3) alat untuk memasukan sampel, (4) kolom,
(5) detektor, (6) wadah penampung fase gerak, (7) tabung penghubung,dan (8) suatu komputer atau integrator atau perekam.diagram blok untuk sistem KCKT ditunjukan oleh gambar 15.1
Wadah fase gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam [inert].wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilang gas) yang ada pada fase gerak ,sebab adanya gasakan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.pada saat membuat pelarut untuk fase gerak,maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi,dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk kckt berderajat KCKT ( HPLC grade) adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.adanya partikel kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut.karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini.
Fase gerak pada KCKT
Fase gerak atau eluen baisanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan daya elusi atau resolusi.daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar dari fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.sementara utuk fase terbaik (fase diam kurang polar daripada fase gerak) kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan paduan yang ber guna dalam memilih fase gerak yang akan digunakan dalam KCKT (tabel 15.1).dalam tabel ini juga disertakan data panjang gelombang UV cut –off (atau pemenggalan uv). Nilai pemenggalan UV merupakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1cm,pelarut akan memberikan absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi.pengetahuan tentang nilai pemenggalan UV ini sangat penting terutama ketika menggunakan detektor UV-Vis dan detektor fluorometri.oleh karena itu, sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase Gerak .
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi).elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.untk pemisahan dengan fase normal,fase gerak yang sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.pemisahan dengan fas normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
Fase diam pada KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT beruapa yang dimodifikasai secara kimia, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer – polimer stirendan divinal benzen. Permukaan silika adalah polar dan seadikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi menggunakan reagaen-reagen seperti klorosilan.reagen-reagen ini akan beraksi dengan gugus silanoldan menggantinya dengan gugus-gugus funsional yang lain sebagaimana dalam gambar 15.3. Hasil reaksi yang diperoleh disebut silika fase terikat yang stabil terhdap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografi dan selektifitas yang ber beda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang palaing banyak digunakan karena mamapu memisahkan senyawa-senyawa dengan kapolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai dengan solut yang polar.silika-silika aminopropil dan sianao propail (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodofikasi akan memberikan waktu yang sangat resenei yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersifat basa, akan memberikan puncak yang mengekor (tailing peak) pada penggunaa fase diam slika fase terikat.hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorpsi antara solut-solut dengan residu silanol dan pengotor logam yang terdapat pada silika.masalah ini dapat diatasi dengan end-capping yakni suatu proses menutup residu silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan menggunakan silika denga kemurnian yang tinggi (kandungan logam < 1ppm)
Fase diam ekslusi dan penukar ion dapat menggunakan silika atau polimer.asam sulfonat merupakan dengan mekanisme penukar kation,sementara amonium kuartener mempunyai mekanisme penukar anion.fase diam kiral telah dikembangkan untuk memisahkan campuran enansioner,akan tetapi fase diam inimahal dan mempunyai waktu yang hidup pendek.tersedianya berbagai macam fase diam jenis fase terikat dan telah memunculkan berbagai macam KCKT.
Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum,tidak bersifat spesifik,dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detekto spsektrometri massa; dan golongan detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
v Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
v Mempunyai sensifitas yang tinggi yakni mempunyai deteksi solut pada kadar yang sangat kecil
v Stabil dalam pengoperasiaanya
v Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau lebih kecil, sedangkan kolom mikrobol selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil lagi.
v Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas ( kisaran dinamis linier )
v Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
2. Kromatografi Kertas
Anda mungkin telah menggunakan kromatografi kertas sebagai salah satu hal pertama yang pernah anda kerjakan dalam bidang kimia untuk pemisahan, misalnya campuran dari pewarna-pewarna yang menyusun warna tinta tertentu. Ini merupakan contoh yang mudah, mari memulai dari hal itu.
Anggaplah anda mempunyai tiga pena biru dan akan mencari tahu dari tiga pena itu, yang mana yang digunakan untuk menulis sebuah pesan. Sampel dari masing-masing tinta diteteskan pada garis dasar pinsil pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut dalam jumlah yang minimum dalam pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis yang sama. Dalam gambar, pena ditandai 1, 2 dan 3 serta tinta pada pesan ditandai sebagai M.
Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada bercak diatasnya. Gambar berikutnya tidak menunjukkan terperinci bagaimana kertas di gantungkan karena terlalu banyak kemungkinan untuk mengerjakannnya dan dapat mengacaukan gambar. Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi berdiri pada bawah wadah.
Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.
Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.
Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang berbeda dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
Gambar menunjukkan apa yang tampak setelah pelarut telah bergerak hampir seluruhnya ke atas.
Gambar menunjukkan apa yang tampak setelah pelarut telah bergerak hampir seluruhnya ke atas.
Dengan sangat mudah dijelaskan melihat dari kromatogram akhir dari pena yang ditulis pada pesan yang mengandung pewarna yang sama dengan pena 2. Anda juga dapat melihat bahwa pena 1 mengandung dua campuran berwarna biru yang kemungkinan salah satunya mengandung pewarna tunggal terdapat dalam pena 3.
Nilai Rf
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh pelarut; beberapa laiinya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat..
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Nilai Rf
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh pelarut; beberapa laiinya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat..
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak 9.6 cm dari garis dasar, sedangkan pelarut bergerak sejauh 12.0 cm, jadi Rf untuk komponen itu:
Dalam contoh kita melihat ada beberapa pena, tidak perlu menghitung nilai Rf karena anda akan membuat perbandingan langsung dengan hanya melihat kromatogram.
Anda membuat asumsi bahwa jika anda memiliki dua bercak pada kromatogram akhir dengan warna yang sama dan telah bergerak pada jarak yang sama pada kertas, dua bercak tersebut merupakan senyawa yang hampir sama. Hal ini tidak selalu benar. Anda dapat saja mempunyai senyawa-senyawa berwarna yang sangat mirip dengan nilai Rf yang juga sangat mirip. Kita akan melihat bagaimana anda menemukan masalah itu pada penjelasan selanjutnya.
Anda membuat asumsi bahwa jika anda memiliki dua bercak pada kromatogram akhir dengan warna yang sama dan telah bergerak pada jarak yang sama pada kertas, dua bercak tersebut merupakan senyawa yang hampir sama. Hal ini tidak selalu benar. Anda dapat saja mempunyai senyawa-senyawa berwarna yang sangat mirip dengan nilai Rf yang juga sangat mirip. Kita akan melihat bagaimana anda menemukan masalah itu pada penjelasan selanjutnya.
3. Kromatografi kolom
Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapakan pada skala besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan untuk pemurnian seyawa di laboratorium.
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel – sampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang – kurangnya 10 kali ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan sedikit cairan.
Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relative zat terlarut melalui system. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon.
Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing – masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi.
Diagram kromatografi kolom konvensional
MANFAAT KROMATOGRAFI KOLOM DALAM DUNIA KEFARMASIAN
Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya.
Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum.
Analisis yang telah dilakukan
4. Kromatografi Gas
Kromatografi gas (GC) digunakan untuk memisahkan komponen mudah menguap dari campuran. Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis disusun menjadi sebuah jarum suntik. Jarum jarum suntik dimasukkan ke port injector yang panas dari gas kromatograf, dan sampel disuntikkan. Yang injector diatur ke suhu yang lebih tinggi daripada komponen ‘titik didih. Jadi, komponen dari campuran menguap ke dalam fasa gas di dalam injector. Seorang carrier gas, seperti helium, mengalir melalui injector dan mendorong komponen gas sampel ke kolom GC. Ini adalah dalam kolom yang pemisahan komponen berlangsung. Molekul partisi antara gas pembawa (fasa mobile) dan cairan mendidih tinggi (fase stasioner) di dalam kolom GC.
Dua kolom yang akan muat di dalam oven GCS kita. Sebuah elemen pemanas digunakan untuk menaikkan suhu oven, bila diinginkan, dan dengan demikian meningkatkan suhu kolom. GC kolom biasanya memiliki tag identifikasi logam dijepitkan ke daftar kolom kolom yang panjang dan diameter, bahan apa yang ada di dalamnya, dan temperatur operasi maksimum.
Setelah komponen dari campuran bergerak melalui kolom GC, mereka mencapai detektor. Idealnya, komponen dari campuran akan mencapai detektor pada waktu yang berbeda-beda karena perbedaan dalam partisi antara ponsel dan fase stasioner. Detektor mengirim sinyal ke perekam grafik yang akan menghasilkan puncak pada kertas. Daerah puncak sebanding dengan jumlah molekul menghasilkan sinyal.
Untuk menggunakan GC, ikuti langkah-langkah sederhana ini:
1. Mencuci jarum suntik dengan aseton dengan mengisi jarum suntik mendepak sepenuhnya dan aseton limbah ke kertas handuk. Cuci 2-3 kali.
2. Tarik beberapa sampel Anda ke dalam jarum suntik. Anda mungkin perlu untuk menghilangkan gelembung udara di dalam tabung suntik oleh plunyer bergerak cepat ke atas dan ke bawah sementara jarum dalam sampel. Biasanya 1-2 mL sampel disuntikkan ke dalam GC. Boleh saja memiliki gelembung udara kecil dalam jarum suntik. Namun, Anda tidak ingin menyuntikkan sebagian besar udara atau puncak Anda akan terlalu kecil pada tabel perekam.
3. Pastikan tabel perekam dan diatur ke kecepatan grafik yang sesuai (Arrow A). Mengatur baseline menggunakan nol pada tabel perekam (Arrow B). Dengan pena di tempat, menyalakan bagan (Arrow D), pastikan pena ke bawah (yang menandai kertas) dan kertas bergerak.
4. Menyuntikkan sampel Anda baik ke kolom A atau kolom B sesuai instruksi. Pegang tingkat jarum suntik dan mendorong jarum sepenuhnya ke injector. Setelah Anda tidak dapat lagi melihat jarum, dengan cepat mendorong pendorong dan kemudian tarik jarum suntik injeksi keluar dari pelabuhan.
Injeksi Catatan:
A) injector sangat panas, jadi berhati-hatilah untuk tidak menyentuh perak disk.
B) Jarum akan melewati septum karet, sehingga Anda akan merasa beberapa perlawanan. Untuk beberapa GC kita itu, kolom tidak menyelaraskan benar dalam injector, sehingga jarum hits bagian depan kolom logam. Jika Anda merasa bahwa Anda mendorong terhadap logam, menarik jarum keluar dari injector dan coba lagi, mungkin di sudut yang sedikit berbeda. Jarum harus benar-benar menghilang ke dalam injeksi untuk injeksi yang tepat sampel ke kolom GC.
C) Suntikkan dengan cepat untuk hasil terbaik. Jangan ragu untuk menyuntikkan jarum setelah benar diposisikan di pelabuhan injeksi.
D) Lepaskan jarum suntik segera setelah injeksi. (Pelaksanaan catatan C dan D membantu untuk memastikan bahwa semua sampel memasuki GC kolom di sekitar waktu yang sama.)
5. Menandai waktu injeksi Anda pada tabel perekam. Ini dapat dilakukan dengan menyesuaikan nol tepat setelah sampel disuntikkan. Hal ini sering nyaman bagi satu orang untuk menyuntikkan sampel sementara pasangan laboratorium menandai waktu injeksi di bagan perekam.
6. Bersihkan jarum suntik Anda segera setelah injeksi. Jarum suntik sering tersumbat dengan cepat dan harus diganti jika mereka tidak dibersihkan setelah setiap penggunaan.
7. Catatan pengaturan perekam grafik Anda selama berjalan. Anda perlu mengetahui kecepatan grafik dan pengaturan skala penuh.
8. Catatan pengaturan GC selama Anda berlari. Sebuah tombol di bagian tengah bawah GC dapat diubah untuk membaca kolom (atau oven) suhu, suhu detektor dan suhu injektor pelabuhan dalam ° C. Jembatan saat ini ditampilkan dalam mA. Perhatikan bahwa ada dua skala pada layar. Berhati-hati untuk membaca skala yang tepat!
Analisa Gas kromatograf
Melaporkan waktu retensi masing-masing puncak (dalam menit), identitas masing-masing komponen dalam campuran, dan komposisi persen campuran. Untuk menentukan komposisi persen, pertama anda perlu mencari luas di bawah kurva masing-masing.
Area = (tinggi) x (lebar di ½ tinggi)
Menandai waktu retensi, tinggi, setengah-tinggi, dan lebar di ketinggian ½ GC jejak Anda. Tunjukkan perhitungan Anda baik dalam laporan akhir Anda atau langsung pada kromatograf.
5. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan,atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponenkomponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda Proses kromatografi juga digunakan dalam metode pemisahan komponen gula dari komponen non gula dan abu dalam tetes menjadi fraksi-fraksi terpisah yang diakibatkan oleh perbedaan adsorpsi, difusi dan eksklusi komponen gula dan non gula tersebut terhadap adsorbent dan eluent yang digunakan (Hongisto dan Heikkila, 1977; Kantasubrata, 1993; Schneider, 1987).
FASE DIAM
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet.Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
Fase diam (Stationary phase = sorbent = adsorbent = penjerap)
: Silika gel
: Alumina
: Selulosa
Silika gel :
- silika gel G à sbg pengikat digunakan gypsum
- silika gel S à sbg pengikat digunakan pati
- silika gel GF 254 à ditambah gypsum dan senyawa
berpendar pada UV l 254 nm
- silika gel H, Silika gel N [ tanpa pengikat ]
- silika gel tanpa pengikat ttp dengan seny.berpendar
- silika gel untuk keperluan preparatif
Alumina :
- alumina asam (pH 4), netral (pH 7), basa (pH 9).
- Pemberian kode seperti silika gel G.H.P.F.
Selulosa :
- serat 2-20 m, serat asli (MN 300), mikrokristal (Avicel) utk senyawa polar. Dengan atau tanpa senyawa fluorescence.
FASE GERAK
Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika). (Kantasubrata, 1993).
- Perkiraan polaritas campuran pelarut:
p’cam = fa.p’a + fb.p’b + fc.p’c + f……
f= fraksi volum
p’= angka kepolaran (Rohrschneider dan Snyder)
Pelarut dengan harga P’ (Introduction to modern liq.chrom.)
Pelarut Heksana 1-klorobutana Isopropil eter Metilen klorida Tetrahidrofuran Kloroform Etanol Etil asetat aseton Metanol Asetonitril Etilena glikol DMSO Air | P’ 0,1 1,0 2,4 3,1 4,0 4,1 4,3 4,4 5,1 5,1 5,8 6,9 7,2 10,2 |
Perbandingan fase diam dan cairan pembuatan pelat
. 1. 2. 3 4. 5. | Fase diam Silika gel G/GF Silika gel H Alumina G Alumina H Kiselgur Serbuk selulosa MN 300 Serbuk poliamid | Jenis cairan Air Air Air Air Air Air Kloroform : metanol=2:3 | Perbandingan Fase diam:cairan ( g : ml ) 30 : 60-65 30 : 80-90 30 : 40 30 : 80-90 30 : 60-65 1 : 5 1: 9 |
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan itu tergantung pada:
© Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
© Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Anggaplah bercak awal pada alumina mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil tiap-tiap bagian interaksi van der Waals yang lemah. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya.
Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan. Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.
Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan hidrogen?
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik-termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
Spektrofotometri
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik ini memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai gelombang
2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.
1. Spektrofotometer Visible
Dalam dunia analisis kimia dikenal suatu alat yang bernama Spektrofotometer visible. Alat ini berdasar hukum Lambert-beer. “Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b), konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi (senyawa) pada suatu panjang gelombang”
Kalimat di atas terlihat sulit untuk dipahami. Dan memang sulit. Biasanya orang tidak mudah untuk mencermati dan memahami tiap kalimat pada hukum Lambert-beer (LB). Belum lagi istilah-istilah yang asing dan tidak biasa bagi kebanyakan orang. Plus persamaan-persamaan yang rumit dan njelimet.
Pada artikel kali ini saya akan menjelaskan sesederhana mungkin. Keluar dari belenggu teoritis dan matematis. Saya menitikberatkan pada prinsip aplikasi alat spektrofotometer ketimbang dasar teori yang melandasi. Istilah asing seperti ‘koefisien absorptivitas molar’, formula hubungan ketebalan media dengan intensitas sinar, tidak akan saya jelaskan detail. Saya mencoba menjelaskan secara sederhana prinsip dasar dari alat spektrofotometer visible (spektro-vis).
Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang serap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang di serap.
Sekarang anda bayangkan sebuah gelas. Gelas tersebut di isi dengan air mineral yang jernih. Kemudian anda lewatkan seberkas sinar melalui gela tersebut, misalnya dengan lampu senter. Cahaya sinar lampu senter akan lewat dengan mudah bukan..? menembus melalui gelas.
Sekarang coba anda ganti isi air mineral dengan air sirup yang berwarna, katakanlah coklat (sirup rasa coklat). Sekarang coba anda lewatkan cahaya lampu senter melalui gelas tersebut. Apa yang terjadi..? Sinar sulit melewati air sirup berwarna. Memang ada yang lewat, tapi tidak semuanya. Sebagian sinar ada yang di serap oleh warna coklat sirup.
Semakin pekat warna pada sirup, sinar lampu senter akan semakin sedikit yang menembus gelas. Dengan kata lain semakin banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang di serap berbanding lurus dengan intensitas warna. Hal inilah yang mendasari pengukuran spektro-vis.
Pengukuran kuantitatif
Apabila anda mempunyai larutan dengan deret warna yang semakin pekat. Kemudian anda mengukur absorbasinya (jumlah cahaya yang diserap). Maka akan didapatkan suatu kurva linier. Jumlah cahaya yang diserap semakin banyak seiring dengan intensitas warna yang semakin pekat. Deret warna ini dalam dunia analisis kimia di sebut sebagai deret standar. Dan jika suatu larutan telah diketahui absorbansinya, maka konsentrasinya-pun dapat diketahui dengan membandingkan terhadap deret standar. Inilah prinsip dasar pengukuran konsentrasi menggunakan spektro-vis.
Limitasi dalam Spketro-Vis
Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah. Pada konsentrasi yang terlalu pekat, kurva deret standar menjadi tidak linier. Biasanya konsentrasi di atas 0.1 M. Hal ini karena pada konsentrasi yang tinggi, jarak antar partikel zat menjadi sangat rapat. Hal ini akan mempengaruhi distribusi muatan, dan mengubah cara molekul melakukan serapan. Oleh karena itu terkadang pada konsentrasi terlalu tinggi kurva tidak linier. Itulah sebabnya pada pembuatan deret standar, absorbansi dianjurkan tidak melebih 1. Jadi absorbansi deret standar ada di dalam range 0-1.
Perbedaan kuvet sangat berpengaruh. Harap selalu gunakan satu kuvet yang sama untuk mengukur absorbansi. Apabila anda terlibat dengan sample yang jumlahnya banyak, dan anda menggunakan kuvet disposable, gunakan kuvet maksimal tiga kali pemakaian. Setelah itu pakai kuvet baru.
Terkadang senyawa analat mengalami reaksi kimia yang lambat dan memerlukan waktu untuk mencapai kesetimbangan. Hal ini menyebabkan penyimpangan yang signifikan bila pembacaan absorbansi tidak dilakukan bersamaan.
Lakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang maksimal. Jangan sungkan untuk mencari terlebih dulu pada panjang gelombang berapa sample memberikan absorbansi maksimal. Hal ini untuk meningkatkan sensitifitas analisa.
Daftar Pustaka
d4him.files.wordpress.com/2009/02/paper-kromatografi-lapis-tipis.pdf
